华大单细胞免疫组库测序
免疫组库是指机体内T淋巴细胞和B淋巴细胞多样性的总和，反映机体免疫系统在特定时间段内对外界刺激应答的能力。单细胞免疫组库可以提供数万个T细胞和B细胞的全长配对受体测序和基因表达谱分析，能够以单细胞分辨率同时研究免疫系统的细胞异质性、T 细胞和 B 细胞库多样性，目前已经广泛应用在包括肿瘤微环境、自身免疫病等多个医学相关领域。基于华大自主单细胞平台，一次性能够分离 500~10,000 个单细胞，利用 5' 端接头的通用引物和免疫分子恒定区的巢式引物进行 V (D) J 富集，并可以同时测定同一细胞 5’基因表达、TCR/BCR 序列信息，以及 TCR α 链和 β 链的配对和 BCR 重链和轻链配对信息，揭示免疫细胞的复杂性
技术原理
- 细胞分离与捕获：通过微流控芯片将单个细胞与带有独特条形码（Barcode）的凝胶微珠（Gel Bead）共同封装在油滴中，实现单细胞分离
- 液滴内逆转录：在液滴环境中，逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA。通过模板转换（TSO序列），在mRNA的5'端合成 3个C碱基，与微珠引物尾部的 rG碱基 互补杂交，完成mRNA 5'端序列的捕获
- 全长cDNA扩增：对逆转录产物进行 全长mRNA扩增，确保覆盖完整转录本
- 产物分选与文库制备：将扩增产物分为 3份，分别进行5’RNA的片段化、加接头等文库制备过程、TCR或BCR的巢式PCR扩增及其他文库制备过程
- 高通量测序：使用测序平台进行测序，获取每个细胞的基因表达数据和VDJ序列
- 数据分析：比对、拼接、筛选与注释等操作构建免疫组库并对TCR/BCR进行克隆分型，将同一细胞的基因表达进行匹配
技术优势
- 基因检出灵敏，中值基因检出＞2,000（PBMC样本）
- 捕获效率高，大于50%
- 细胞识别精确，液滴多胞微珠可区分
- 液滴污染率低，细胞多胞率每1,000个细胞小于0.4%
- 投入细胞梯度范围广，5,000~30,000
- 兼容细胞尺寸大，液滴尺寸大，可兼容较大直径细胞，直径＜60μm
- 克隆性检出能力强，TRA/TRB配对率＞65%（PBMC样本）
应用方向
- 新抗体的发现：获得特征性的 BCR 序列，缩短抗体开发流程
- 自身免疫疾病：发现异常表达的免疫细胞，寻找生物标志物
- 癌症早期检测：癌症进程和复发诊断的标记物以及肿瘤免疫机制的研究
- 用药及疫苗评估：评估某种疾病用药后的外周血免疫细胞，确认药物功效
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