nCounter技术服务

        nCounter 是一种荧光分子标签技术，应用 布鲁克（原NanoString ）的荧光分子条形码，仅需冷冻组织约 25-50 ng RNA 或 FFPE 约150~300 ng RNA 即可对超过八百种特异的mRNA转录本进行准确定量；整个流程中不需要反转录和 PCR，省去了酶促和扩增可能引入偏差的过程，但其检测的灵敏度和准确性媲美实时荧光定量 PCR。

       该技术的实验方法简单易操作，单次反应只需15分钟人工操作，可直接测定新鲜组织和FFPE样品中的RNA提取物。

nCounter检测 RNA表达谱的基本原理：

        针对每一个靶标的RNA设计一对探针：捕获探针和报告探针，它们分别具有与该RNA互补的一段100个碱基的序列中的前50个碱基和后50个碱基，而捕获探针又在这50个碱基的寡核苷酸链上偶联了生物素，报告探针则偶联了带有6个荧光基团的条形码。该荧光基团条形码是通过4 种不同颜色的荧光基团串联而成的，通过不同的荧光基团的排列组合，该荧光条形码的制备方式可实现对 800 多种不同的RNA的标记。

       布鲁克NanoString 设计了可识别多个RNA的探针池，待测样本的 RNA与这些探针在液相中进行杂交时，可与样品中的目的核酸杂交互补结合形成三聚复合物。该三聚复合物的荧光条形码可在nCounter仪器中被识别且被一对一计数，即一个条形码就被计数为一个Count。nCounter 识别各荧光条形码计数所有靶标RNA，并将其转化成可用于生信分析的表达矩阵从而实现对表达谱的检测。

图 丨nCounter技术原理

nCounter 的检测系统包括独立的样品纯化工作站和数据信号采集仪；流程包括杂交、纯化固定、计数三个步骤。具体实验流程如下图所示：

1）选择包含待测靶标RNA的检测Panel（探针池），将待测样本的 RNA与这些探针在PCR 仪中进行液相杂交过夜；

2）第二天取出杂交产物，通过指定的标准操作流程将杂交产物加入到nCounter的纯化工作站Prep Station中进行纯化，收集待测目的核酸、捕获探针和报告探针形成的三聚复合物；

3）将纯化好的产物放入nCounter的数据采集仪Digital Analyzer中进行计数定量。定量完成后将数据文件下机，并进行数据质控和生信分析等。一般项目的实际实验流程在如下图所示，因不同项目可能存在不同实验设计方案，下图流程以具体情况为准。

图 丨nCounter 研究流程

• 样本友好：对FFPE样本中降解程度极高的核酸也能有效检出；

• 样本要求低：nCounter不止对样本质量要求比 RNA-seq 低，在样本量的要求上也比 RNA-seq 更友好。

• 检测性能好： nCounter对 FFPE 样本中的 mRNA 分子用荧光条形码直接标记，直接检测计数，无需反转录和扩增，从而避免了逆转录和 PCR 扩增带来的偏好性，比传统的 RNA 检测技术具有更高的精准度和重复性。

         nCounter 技术的特点及优势使其被越来越广泛地应用到生物医学前沿领域，包括高通量基因表达结果验证、基因表达谱研究、基因调控机理、基因调控网络研究、临床疾病分子分型及诊断预后等领域。

       通过应用荧光分子条形码，研究人员可以在样本中一次性检测高达近千种基因。目前已发表的应用包括基因表达、蛋白质定量、拷贝数目变异 （CNV）、单核苷酸多态性（SNV）、融合基因 (Gene Fusion)。